Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via email.Torna a Diari » Diabete, sindrome metabolica e obesità: obiettivi e terapia » Volume 15L'astragaloside IV migliora l'apoptosi e la disfunzione delle β-cellule pancreatiche indotte dalla streptozotocina attraverso le vie di segnalazione SIRT1/P53 e Akt/GSK3β/Nrf2Autori Lin Y, Xu Y, Zheng X, Zhang J, Liu J, Wu GPubblicato il 13 gennaio 2022 Volume 2022:15 Pagine 131—140DOI https://doi.org/10.2147/DMSO.S347650Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Prof. Dr. Juei-Tang ChengYuqiong Lin,1 Ying Xu,1 Xin Zheng,1 Jingwen Zhang,1 Junfeng Liu,1 Guotu Wu2 1Dipartimento di scienze mediche di base, Fujian Health College, Fuzhou, 350101, provincia del Fujian, Repubblica popolare cinese;2Dipartimento di scienze mediche di base, Università di medicina del Fujian, Fuzhou, 350101, provincia del Fujian, Repubblica popolare cinese Corrispondenza: Dipartimento di scienze mediche di base di Yuqiong Lin, Fujian Health College, città di Jingxi n. 366, Fuzhou, 350101, provincia del Fujian, Repubblica popolare of China Email [email protected] Contesto: La mancanza assoluta o relativa di secrezione di insulina causata dalla disfunzione delle cellule β del pancreas può portare al diabete.L'astragaloside IV (AS-IV), i componenti principali della medicina tradizionale cinese Astragalo, ha proprietà antiossidanti, antinfiammatorie e antiapoptotiche, ed esercita effetti farmacologici antidiabetici.Scopo: esplorare se l'AS-IV può proteggere l'apoptosi e la disfunzione delle cellule β del pancreas indotte dalla streptozotocina (STZ) e dal suo meccanismo molecolare sottostante.Metodi: la linea β-cellulare pancreatica indotta da STZ INS-1 è stata trattata con diverse concentrazioni di AS-IV, quindi la vitalità cellulare, l'apoptosi, lo stress ossidativo e la secrezione di insulina è stata valutata mediante CCK-8, colorazione TUNEL, Western blot, kit commerciali e qRT-PCR, rispettivamente.L'espressione delle proteine ​​coinvolte nella segnalazione di Sirtuin 1 (SIRT1)/p53 e Akt/glicogeno sintasi chinasi-3 β (GSK3β)/fattore nucleare E2 correlato al fattore 2 (Nrf2) è stata misurata mediante saggio Western blot.Inoltre, l'inibitore Akt MK-2206 e l'inibitore SIRT1 EX-527 sono stati usati per co-trattare le cellule INS-1 indotte da STZ in presenza di AS-IV e gli esperimenti di cui sopra sono stati ripetuti.Risultati: AS-IV ha aumentato la vitalità cellulare delle cellule INS-1 indotte da STZ.AS-IV ha anche ridotto l'aumento del tasso di apoptosi e ha invertito la down-regulation indotta da STZ di Bcl-2 e l'up-regulation di Bax e Cleaved caspase 3. Inoltre, AS-IV ha ridotto significativamente la sovraregolazione della malondialdeide indotta da STZ e ha ridotto la superossido dismutasi e livelli di glutatione perossidasi.Inoltre, è stato riscontrato che l'uso di AS-IV aumenta la capacità di secrezione di insulina delle cellule INS-1 con funzione ridotta, insieme all'aumento dei livelli di mRNA di insulina 1 e insulina 2. Studi sul meccanismo hanno inoltre dimostrato che MK-2206 ed EX -527 ha invertito l'effetto protettivo di AS-IV contro il danno indotto da STZ sulle cellule INS-1.Conclusione: AS-IV ha esercitato un effetto citoprotettivo sulle cellule INS-1 indotte da STZ attraverso la regolazione delle vie di segnalazione SIRT1/p53 e Akt/GSK3β/Nrf2.Questi risultati dovrebbero fornire nuovi supplementi al meccanismo molecolare dell'AS-IV nel trattamento del diabete.Parole chiave: astragaloside IV, cellule β pancreatiche, apoptosi, disfunzione, SIRT1/p53, Akt/GSK3β/Nrf2L'astragaloside IV (AS-IV) è estratto dalla medicina tradizionale cinese Astragalo.È il principale ingrediente attivo dell'astragalo, spesso usato come standard per valutare la qualità dell'astragaloside.1 È stato riscontrato che l'AS-IV ha proprietà antinfiammatorie, anti-stress ossidativo, anti-apoptotiche ed è un potenziale principio attivo per la prevenzione e il trattamento del diabete e delle sue complicanze.2 La somministrazione di AS-IV a un modello murino di diabete gestazionale (GDM) ha ridotto significativamente i livelli di glucosio, insulina e lipidi nei topi GDM riducendo anche la gluconeogenesi epatica.3 In un modello di ratto della cardiomiopatia diabetica (DCM), è stato anche dimostrato che AS-IV protegge i cardiomiociti dai danni inibendo lo stress ossidativo e l'autofagia indotti dall'alto glucosio.4 Le cellule β pancreatiche svolgono un ruolo importante nel processo del diabete e i suoi cambiamenti dinamici hanno un impatto fondamentale sulla regolazione della glicemia e sull'insorgenza di complicanze croniche.5 Tuttavia, per quanto ne sappiamo, l'effetto dell'AS-IV sulle cellule β del pancreas non è stato riportato.Anche gli altri due medicinali tradizionali cinesi, l'olio di semi di melone Sanbai (SMSO) e il ginsenoside Rg1 (Rg1) svolgono un ruolo importante nel trattamento del diabete.Secondo i rapporti, tutti loro possono proteggere le cellule β del pancreas regolando la via Akt/glicogeno sintasi chinasi-3 β (GSK3β)/fattore nucleare E2 correlato al fattore 2 (Nrf2) e inducendo l'espressione di proteine ​​antiossidanti.6,7 Il è stato anche scoperto che il noto fattore pro-sopravvivenza Sulfiredoxin-1 (Srxn1) promuove l'attivazione della via di segnalazione antiossidante Nrf2 sovraregolando la fosforilazione di Akt e GSK3β per svolgere un effetto protettivo sulle cellule gangliari retiniche dei pazienti diabetici .8 Inoltre, Perilipin 5 previene anche l'apoptosi, lo stress ossidativo e l'infiammazione indotti dall'alto contenuto di zucchero nei podociti attraverso questo percorso.9 Nella presente relazione, è stato riportato che AS-IV inibisce la transizione epiteliale-mesenchimale del carcinoma epatocellulare prendendo di mira Akt /GSK3β via di segnalazione.10 Tuttavia, non è ancora noto se il meccanismo del trattamento AS-IV del diabete coinvolga la via Akt/GSK3β/Nrf2.Oltre alla via di segnalazione Akt/GSK3β, la via di segnalazione Sirtuin 1 (SIRT1) può anche aumentare la trascrizione di Nrf2 deacetilando PGC1-α.11,12 SIRT1, poiché l'enzima più studiato tra le 7 deacetilasi della famiglia Sir, è ampiamente presente in varie cellule del corpo ed è strettamente correlato al metabolismo energetico e allo stato di riduzione delle cellule.13,14 È un nuovo potenziale bersaglio terapeutico per la nefropatia diabetica.15,16 Lo studio ha rilevato che sebbene l'attivatore SIRT1 SRT2104 possa attivare l'espressione di SIRT1 in topi knockout Nrf2 e inibisce P53, il suo effetto protettivo sulla nefropatia diabetica viene eliminato.17 Nel processo di apoptosi mitocondriale-dipendente nel ganglio della radice dorsale di ratti con neuropatia periferica diabetica, è stato rilevato che AS-IV può sovraregolare l'espressione di SIRT1 e inibiscono l'attivazione di P53.18 Il resveratrolo protegge la secrezione di insulina delle cellule INS-1 indotta dall'etanolo attraverso l'asse SIRT1/UCP2.19 Se il meccanismo del trattamento dell'AS-IVt del diabete coinvolge la via di segnalazione SIRT1 resta da esplorare.Questo studio mira a costruire un modello di lesione delle cellule β del pancreas in vitro incubando le cellule INS-1 con STZ per esplorare se AS-IV può proteggere le cellule β del pancreas attraverso l'effetto delle vie di segnalazione SIRT1/p53 e Akt/GSK3β/Nrf2.La linea β-cellulare pancreatica INS-1 (Procell Life Science&Technology) è stata coltivata in RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) integrato con il 10% di FBS (Corning), 50 μmol/L di β-mercaptoetanolo (Procell Life Science&Technology) e l'1% di penicillina- streptomicina (Beyotime Biotechnology) e mantenuta a 37°C in un'incubatrice umidificata con il 5% di CO2.Le cellule INS-1 sono state incubate con streptozotocina 3 mM (STZ; Sigma-Aldrich) per 24 ore per costruire un modello di lesione delle cellule β del pancreas in vitro,20 e quindi incubate con o senza AS-IV (10, 20, 40 µM; disciolto in DMSO alla concentrazione finale di 50 mM; Shanghai Yuanye Biotechnology) per 4 h.Per l'analisi della via di segnalazione, dopo la stimolazione STZ per 24 ore, le cellule INS-1 sono state pretrattate con l'inibitore Akt MK-2206 (100 nM; Beyotime Biotechnology) per 72 ore o con l'inibitore SIRT1 EX-527 (10 µM; Beyotime Biotechnology) per 48 h prima della somministrazione dell'AS-IV.21,22L'RNA totale è stato estratto dalla linea cellulare INS-1 coltivata utilizzando un kit di isolamento dell'RNA (HaiGene Biotech Co., Ltd.), secondo le istruzioni del produttore.L'RNA totale è stato invertito in cDNA utilizzando un kit di reagenti PrimeScript™ RT (Perfect Real Time) (Takara Bio, Inc.).La qPCR è stata successivamente eseguita su un sistema StepOnePlus™ Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific, Inc.) utilizzando un kit One Step TB Green® PrimeScript™ plus RT-PCR (Perfect Real Time) (Takara Bio, Inc.), secondo il protocollo del produttore.Per la qPCR sono state utilizzate le seguenti condizioni di termociclaggio: denaturazione iniziale a 42°C per 5 min e 95°C per 10 sec, seguita da 40 cicli di 95°C per 5 sec e 60°C per 30 sec.Per la qPCR sono state utilizzate le seguenti coppie di primer per Insulina 1, Insulina 2 e GAPDH: 23 Insulina 1 in avanti, 5'-GTCCTCTGGGAGCCCAAG-3' e inversa, 5'-ACAGAGCCTCCCACCAGG-3';Insulina 2 in avanti, 5'-ATCCTCTGGGAGCCCCGC-3' e inversa, 5'-AGAGAGCTTCCCACCAAG-3';e β-actina avanti, 5'-ACCCGCCACCAGTTCGC-3' e retromarcia, 5'-CACGATGGGAGGGAAGACG-3'.La β-actina è stata utilizzata per la normalizzazione.Dopo i trattamenti indicati con STZ, AS-IV, EX527 e MK2206, l'espressione delle proteine ​​nelle cellule INS-1 è stata misurata mediante analisi WB come precedentemente riportato.24 La proteina totale è stata preparata aggiungendo Cell Lysis (ThermoFisher), dopodiché sono state isolato mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE; Beyotime Biotechnology) e trasferito su membrane PVDF (Millipore).Dopo l'incubazione in 5% di latte scremato in polvere sciolto in 0,1% Tween-20 soluzione salina tamponata con trietanolamina (TBST) per 2 ore a temperatura ambiente, incubare a 4°C con l'anticorpo primario corrispondente durante la notte.Lavato in TBST 3 volte, l'anticorpo secondario coniugato con HRP è stato utilizzato per un'ulteriore incubazione per 1 ora a temperatura ambiente, per il rilevamento è stato utilizzato il reagente Western blot chemiluminescente SuperSignal West Pico Plus (ThermoFisher).L'immagine è stata scansionata con uno scanner densitometro Bio-Rad GS800 e il software ImageJ 1.46 è stato utilizzato per l'analisi dei dati.Anticorpi primari: coniglio anti-Bcl-2 (1:2000, ab196495, Abcam);coniglio anti-Bax (1:8000, ab32503, Abcam);coniglio anti-Cleaved caspase 3 (1:1000, 9664, Cell Signaling Technology);coniglio anti-caspasi 3 (1:1000, 9662, tecnologia di segnalazione cellulare);anti-β actina di coniglio (1:5000, ab8227, Abcam);coniglio anti-SIRT1 (1:1000, ab189494, Abcam);coniglio anti-p53 (1:800, ab131442, Abcam);coniglio anti-Akt (1:1000; 9272, Cell Signaling Technology);coniglio anti-p-Akt (1:2000, 4060S, Cell Signaling Technology);coniglio anti-GSK3β (1:1000, 9315, tecnologia di segnalazione cellulare);e coniglio anti-Phospho-GSK3β (1:1000, 9315, Cell Signaling Technology).Anticorpi secondari coniugati con HRP: capra anti-coniglio IgG H&L (HRP) (1:20.000, ab6721, Abcam);anti-topo di capra IgG H&L (HRP) (1:10.000, ab6789, Abcam).L'apoptosi cellulare è stata valutata utilizzando il test TUNEL.25 5 × 104 cellule INS-1/pozzetto sono state seminate in piastre da 24 pozzetti e coltivate per una notte per l'attacco, seguite da trattamenti indicati con STZ, AS-IV, EX527 e MK2206.Successivamente, è stato utilizzato il kit di test dell'apoptosi TUNEL One Step (cat. n. C1088; Beyotime Biotechnology) per determinare l'apoptosi cellulare secondo le raccomandazioni del produttore.Le normali cellule INS-1 senza trattamento sono state utilizzate come controllo.I livelli di apoptosi sono stati stimati come il rapporto tra il numero di cellule TUNEL-positive e il numero totale di cellule DAPI-positive utilizzando un microscopio a fluorescenza (Olympus Corporation) con ingrandimento 200 volte.5 × 104 cellule/pozzetto INS-1 sono state seminate in piastre da 24 pozzetti e coltivate durante la notte per l'attacco, seguite dai trattamenti indicati con STZ, AS-IV, EX527 e MK2206.Per misurare i livelli di stress ossidativo nelle cellule INS-1, kit di test di perossidazione lipidica (MDA) (cat. no ab118970; Abcam), kit di test di attività della superossido dismutasi (SOD) (cat. no ab65354; Abcam) e rapporto GSH/GSSG ( È stato utilizzato il kit di test di rilevamento GSH-Px) (cat. no ab138881; Abcam), secondo il protocollo dei produttori.La secrezione di insulina (INS) nel mezzo di coltura delle cellule INS-1 è stata rilevata dal kit ELISA per insulina di ratto (INS) (cat. n. JN5756; Shanghai Jining Shiye).In breve, 2 × 106 cellule INS-1 sono state seminate in piastre da 6 pozzetti e coltivate durante la notte per l'attacco, seguite dai trattamenti indicati con STZ, AS-IV, EX527 e MK2206.Successivamente, le cellule sono state raccolte e centrifugate a 1000 × g per 20 minuti per ottenere il supernatante, il rilascio di INS in cui è stato quindi determinato secondo la raccomandazione del produttore.Per determinare la vitalità cellulare è stato utilizzato il kit di analisi CCK8 (cat. n. C0038; Beyotime Biotechnology).Un totale di 2 × 104 cellule INS-1/pozzetto sono state seminate in un 96 pozzetti e coltivate durante la notte per l'attacco, seguite dai trattamenti indicati con STZ, AS-IV, EX527 e MK2206.Le cellule sono state quindi incubate con il reggente CCK-8 per 2 ore a 37°C, l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 450 nm è stata misurata utilizzando un lettore di micropiastre automatizzato (spettrofotometro Beckman DU6400).L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, Inc.).Le variabili continue sono presentate come media ± deviazione standard da tre esperimenti indipendenti.I valori P sono stati calcolati utilizzando il test t di Student non accoppiato per i confronti tra due gruppi o l'ANOVA unidirezionale con il test di Tukey per i confronti tra più gruppi.I valori P<0,05 sono stati considerati significativi.AS-IV è una sostanza chimica glicoside triterpenico di tipo cicloalcano (Figura 1A).Al fine di escludere la concentrazione appropriata di AS-IV, abbiamo prima incubato le cellule INS-1 con diverse concentrazioni di AS-IV (0, 10, 20, 40 µM) per 4 ore e testato la vitalità cellulare corrispondente.I risultati hanno mostrato che 0-40 µM AS-IV non influirà sulla vitalità cellulare (Figura 1B).Successivamente, abbiamo incubato le cellule INS-1 con STZ per 24 ore e abbiamo continuato il trattamento con diverse concentrazioni di AS-IV per 4 ore.I risultati hanno mostrato che il trattamento STZ ha ridotto significativamente la vitalità cellulare delle cellule INS-1, mentre dopo l'aggiunta di AS-IV, la vitalità cellulare è aumentata in modo dose-dipendente (Figura 1C).Questi dati hanno indicato che AS-IV ha un effetto protettivo significativo sulla vitalità cellulare INS-1 indotta da STZ.La figura 1 AS-IV migliora la vitalità cellulare INS-1 indotta da STZ.(A) La struttura chimica dell'astragaloside IV.(B e C) La vitalità cellulare è stata rilevata dal test Cell Counting Kit-8.Le normali cellule INS-1 senza trattamento STZ e AS-IV sono state servite come controllo.***P<0,001 rispetto al controllo;#P<0,05, ##P<0,01 vs STZ+ AS-IV.Abbreviazioni: AS-IV, astragaloside IV;STZ, streptozotocina.La figura 1 AS-IV migliora la vitalità cellulare INS-1 indotta da STZ.(A) La struttura chimica dell'astragaloside IV.(B e C) La vitalità cellulare è stata rilevata dal test Cell Counting Kit-8.Le normali cellule INS-1 senza trattamento STZ e AS-IV sono state servite come controllo.***P<0,001 rispetto al controllo;#P<0,05, ##P<0,01 vs STZ+ AS-IV.Abbreviazioni: AS-IV, astragaloside IV;STZ, streptozotocina.Per studiare l'effetto protettivo di AS-IV sull'apoptosi cellulare INS-1 indotta da STZ, diverse concentrazioni di AS-IV (0, 10, 20, 40 µM) sono state aggiunte alle cellule pretrattate con STZ.Il test TUNEL e l'analisi Western blot sono stati utilizzati per determinare la percentuale di cellule apoptotiche nelle cellule totali e i cambiamenti delle proteine ​​​​correlate all'apoptosi.I risultati hanno mostrato che STZ ha causato in modo significativo l'apoptosi delle cellule INS-1, con un tasso di apoptosi superiore al 20%, accompagnato da una diminuzione dell'espressione di Bcl-2 e da un aumento dell'espressione di Bax e Cleaved-caspase 3. L'uso del trattamento con AS-IV ha invertito significativamente l'apoptosi causata da STZ e il tasso di apoptosi ha continuato a diminuire con l'aumento della concentrazione di AS-IV (Figura 2).Questi dati hanno suggerito che AS-IV ha un effetto protettivo sull'apoptosi delle cellule INS-1 indotta da STZ e l'effetto protettivo aumenta con l'aumento della concentrazione di AS-IV entro un certo intervallo.La figura 2 AS-IV inibisce l'apoptosi indotta da STZ delle cellule INS-1.(A) L'apoptosi cellulare è stata valutata utilizzando un test TUNEL e (B) quantificata.(C) I livelli di espressione delle proteine ​​​​correlate all'apoptosi, Bcl-2, Bax, caspasi 3 e caspasi 3 sono stati determinati utilizzando Western blotting e semi-quantificato.La β-actina è stata utilizzata come controllo del carico.Le normali cellule INS-1 senza trattamento STZ e AS-IV sono state servite come controllo.***P<0,001 rispetto al controllo;#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs STZ+ AS-IV.Abbreviazioni: AS-IV, astragaloside IV;STZ, streptozotocina.La figura 2 AS-IV inibisce l'apoptosi indotta da STZ delle cellule INS-1.(A) L'apoptosi cellulare è stata valutata utilizzando un test TUNEL e (B) quantificata.(C) I livelli di espressione delle proteine ​​​​correlate all'apoptosi, Bcl-2, Bax, caspasi 3 e caspasi 3 sono stati determinati utilizzando Western blotting e semi-quantificato.La β-actina è stata utilizzata come controllo del carico.Le normali cellule INS-1 senza trattamento STZ e AS-IV sono state servite come controllo.***P<0,001 rispetto al controllo;#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs STZ+ AS-IV.Abbreviazioni: AS-IV, astragaloside IV;STZ, streptozotocina.Per verificare se l'AS-IV potrebbe alleviare lo stress ossidativo indotto da STZ nelle cellule INS-1, abbiamo rilevato la perossidazione lipidica, l'attività della superossido dismutasi e il GSH-Px delle cellule pretrattate STZ incubate con diverse concentrazioni di AS-IV (0, 10, 20 , 40 µM).Il pretrattamento delle cellule INS-1 con STZ ha causato stress ossidativo cellulare, che si è manifestato con un aumento dei livelli di MDA e una diminuzione dei livelli di SOD e GSH-Px.Dopo l'aggiunta di AS-IV, queste condizioni sono state invertite in modo dose-dipendente (Figura 3).Questi dati hanno indicato che AS-IV ha anche un effetto alleviante sullo stress ossidativo indotto da STZ nelle cellule INS-1.La figura 3 AS-IV riduce lo stress ossidativo indotto da STZ nelle cellule INS-1.(A) La perossidazione lipidica, (B) l'attività della superossido dismutasi e (C) il rapporto GSH/GSSG sono stati determinati utilizzando il kit corrispondente.Le normali cellule INS-1 senza trattamento STZ e AS-IV sono state servite come controllo.***P<0,001 rispetto al controllo;#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs STZ+ AS-IV.Abbreviazioni: AS-IV, astragaloside IV;STZ, streptozotocina;MDA, malondialdeide;SOD, superossido dismutasi;GSH-Px, glutatione perossidasi.La figura 3 AS-IV riduce lo stress ossidativo indotto da STZ nelle cellule INS-1.(A) La perossidazione lipidica, (B) l'attività della superossido dismutasi e (C) il rapporto GSH/GSSG sono stati determinati utilizzando il kit corrispondente.Le normali cellule INS-1 senza trattamento STZ e AS-IV sono state servite come controllo.***P<0,001 rispetto al controllo;#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs STZ+ AS-IV.Abbreviazioni: AS-IV, astragaloside IV;STZ, streptozotocina;MDA, malondialdeide;SOD, superossido dismutasi;GSH-Px, glutatione perossidasi.In quanto linea cellulare di isole pancreatiche di ratto, le cellule INS-1 hanno la funzione di secrezione di insulina.La nostra ricerca ha confermato che il trattamento delle cellule INS-1 con STZ inibisce significativamente la loro capacità di secernere insulina.Con diverse concentrazioni di AS-IV (0, 10, 20, 40 µM) per il trattamento, le cellule INS-1 hanno parzialmente ripristinato la loro capacità di secrezione di insulina e la quantità di secrezione è stata correlata positivamente con la concentrazione di AS-IV (Figura 4) .In generale, l'uso di AS-IV ha contribuito a ripristinare parzialmente la disfunzione della secrezione di insulina delle cellule INS-1 causata da STZ.La figura 4 AS-IV migliora la secrezione di insulina indotta da STZ nelle cellule INS-1.(A) I livelli di secrezione di insulina sono stati rilevati utilizzando il kit ELISA corrispondente.I livelli relativi di mRNA dell'insulina (B) 1 e dell'insulina (C) 2 sono stati determinati tramite RT-qPCR.Le normali cellule INS-1 senza trattamento STZ e AS-IV sono state servite come controllo.***P<0,001 rispetto al controllo;#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs STZ+ AS-IV.Abbreviazioni: AS-IV, astragaloside IV;STZ, streptozotocina;INS, insulina.La figura 4 AS-IV migliora la secrezione di insulina indotta da STZ nelle cellule INS-1.(A) I livelli di secrezione di insulina sono stati rilevati utilizzando il kit ELISA corrispondente.I livelli relativi di mRNA dell'insulina (B) 1 e dell'insulina (C) 2 sono stati determinati tramite RT-qPCR.Le normali cellule INS-1 senza trattamento STZ e AS-IV sono state servite come controllo.***P<0,001 rispetto al controllo;#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs STZ+ AS-IV.Abbreviazioni: AS-IV, astragaloside IV;STZ, streptozotocina;INS, insulina.Per studiare ulteriormente l'effetto terapeutico di AS-IV sull'apoptosi indotta da STZ e sulla disfunzione delle cellule INS-1, abbiamo esaminato l'espressione della proteina relativa delle vie di segnalazione SIRT1/p53 e Akt/GSK3β/Nrf2 mediante analisi Western blot.Abbiamo scoperto che dopo il trattamento con STZ, i livelli di espressione di SIRT1 e Nrf2, nonché i livelli di fosforilazione di Akt e GSK3p53 nelle cellule INS-1 erano significativamente sottoregolati insieme all'espressione sovraregolata di p53.Pertanto, abbiamo determinato che le vie di segnalazione SIRT1/p53 e Akt/GSK3β/Nrf2 sono coinvolte nell'apoptosi e nella disfunzione delle cellule INS-1 indotte da STZ.Aggiungendo diverse concentrazioni di AS-IV (0, 10, 20, 40 µM) per il trattamento, i livelli di espressione e i livelli di fosforilazione delle proteine ​​​​del percorso sopra menzionate sono stati significativamente invertiti (Figura 5).Questi risultati hanno suggerito che le vie di segnalazione SIRT1/p53 e Akt/GSK3β/Nrf2 possono essere coinvolte nell'effetto terapeutico dell'AS-IV sull'apoptosi e disfunzione delle cellule S-1 indotte da STZ.La Figura 5 AS-IV regola le vie di segnalazione SIRT1/p53 e Akt/GSK3β/Nrf2.I livelli di espressione delle proteine ​​​​correlate al percorso, SIRT1, p53, p-Akt, Akt, p-GSK3β, GSK3β e Nrf2, sono stati determinati mediante Western blotting e semi-quantificato.La β-actina è stata utilizzata come controllo del carico.Le normali cellule INS-1 senza trattamento STZ e AS-IV sono state servite come controllo.***P<0,001 rispetto al controllo;##P<0.01, ###P<0.001 vs STZ+ AS-IV.Abbreviazioni: AS-IV, astragaloside IV;STZ, streptozotocina;SIRT1, Sirtuina 1;p53, proteina tumorale P53;Akt, Akt Serina/Treonina chinasi 1;GSK3β, glicogeno sintasi chinasi 3 Beta;Nrf2, fattore nucleare, eritroide 2 come 2.La Figura 5 AS-IV regola le vie di segnalazione SIRT1/p53 e Akt/GSK3β/Nrf2.I livelli di espressione delle proteine ​​​​correlate al percorso, SIRT1, p53, p-Akt, Akt, p-GSK3β, GSK3β e Nrf2, sono stati determinati mediante Western blotting e semi-quantificato.La β-actina è stata utilizzata come controllo del carico.Le normali cellule INS-1 senza trattamento STZ e AS-IV sono state servite come controllo.***P<0,001 rispetto al controllo;##P<0.01, ###P<0.001 vs STZ+ AS-IV.Abbreviazioni: AS-IV, astragaloside IV;STZ, streptozotocina;SIRT1, Sirtuina 1;p53, proteina tumorale P53;Akt, Akt Serina/Treonina chinasi 1;GSK3β, glicogeno sintasi chinasi 3 Beta;Nrf2, fattore nucleare, eritroide 2 come 2.Per testare ulteriormente la nostra ipotesi, è stato utilizzato EX527 (inibitore SIRT1) o MK2206 (inibitore Akt).L'aggiunta di EX527 e MK2206 alle cellule INS-1 pretrattate con STZ ha indebolito il ruolo di AS-IV nella protezione delle cellule dall'apoptosi e il tasso apoptotico delle cellule INS-1 trattate con EX527 era superiore a quello trattato con MK2206 (Figura 6A e B).I dati sperimentali ottenuti dall'analisi Western blot erano coerenti con questo, entrambi gli inibitori hanno indotto l'up-regulation dell'espressione di Bax e Cleaved caspase 3 e la down-regulation dell'espressione di Bcl-2.Inoltre, EX527 ha avuto un effetto maggiore su Bcl-2 rispetto a MK2206 (Figura 6D).Dai risultati del test CCK-8, l'uso di EX527 ha parzialmente indebolito l'effetto protettivo di AS-IV sulla vitalità cellulare INS-1, mentre l'uso di MK2206 non ha avuto effetti significativi sulla vitalità cellulare (Figura 6C).Inoltre, rispetto alle cellule INS-1 indotte da STZ trattate con AS-IV, le cellule INS-1 trattate sia con EX527 che con MK2206 hanno mostrato un aumento del livello di stress ossidativo, come evidenziato da un aumento di MDA e una diminuzione di SOD e GSH-Px, suggerendo che l'effetto inibitorio di AS-IV sullo stress ossidativo indotto da STZ nelle cellule INS-1 è stato invertito sia da EX527 che da MK2206 (Figura 6E).Infine, abbiamo esplorato gli effetti di due inibitori sulla capacità di secrezione di insulina delle cellule INS-1.I risultati hanno mostrato che l'uso di EX527 e MK2206 per trattare le cellule INS-1 pre-incubate STZ limitava l'effetto terapeutico di AS-IV.L'espressione di INS, insulina 1 e insulina 2 è stata significativamente ridotta e MK2206 ha avuto un impatto maggiore (Figura 6F).In conclusione, questi risultati hanno suggerito che AS-IV può proteggere le cellule INS-1 dall'apoptosi indotta da STZ principalmente attraverso l'attivazione di SIRT1 e può alleviare lo stress ossidativo indotto da STZ e la disfunzione della secrezione di insulina attraverso l'attivazione della via antiossidante Nrf2 da parte di Akt.La figura 6 EX527 (inibitore SIRT1) o MK2206 (inibitore Akt) ha invertito l'effetto protettivo di AS-IV sulle cellule INS-1 indotte da STZ.(A) L'apoptosi cellulare è stata valutata utilizzando un test TUNEL e (B) quantificata.(C) La vitalità cellulare è stata rilevata dal test Cell Counting Kit-8.(D) I livelli di espressione delle proteine ​​​​correlate all'apoptosi, Bcl-2, Bax, caspasi 3 e caspasi 3 sono stati determinati utilizzando Western blotting e semi-quantificato.La β-actina è stata utilizzata come controllo del carico.(E) La perossidazione lipidica, l'attività della superossido dismutasi e il rapporto GSH/GSSG sono stati determinati utilizzando il kit corrispondente.(F) I livelli di secrezione di insulina sono stati rilevati utilizzando il kit ELISA corrispondente e i livelli relativi di mRNA di (G) insulina 1 e (H) insulina 2 sono stati determinati tramite RT-qPCR.Le normali cellule INS-1 senza trattamento STZ, AS-IV, EX527 e MK2206 sono state servite come controllo.***P<0,001 vs Controllo;#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs STZ+ AS-IV+.Abbreviazioni: AS-IV, astragaloside IV;STZ, streptozotocina;Bcl-2, regolatore dell'apoptosi BCL2;Bax, X associato a BCL2, regolatore dell'apoptosi;MDA, malondialdeide;SOD, superossido dismutasi;GSH-Px, glutatione perossidasi;INS, insulina.La figura 6 EX527 (inibitore SIRT1) o MK2206 (inibitore Akt) ha invertito l'effetto protettivo di AS-IV sulle cellule INS-1 indotte da STZ.(A) L'apoptosi cellulare è stata valutata utilizzando un test TUNEL e (B) quantificata.(C) La vitalità cellulare è stata rilevata dal test Cell Counting Kit-8.(D) I livelli di espressione delle proteine ​​​​correlate all'apoptosi, Bcl-2, Bax, caspasi 3 e caspasi 3 sono stati determinati utilizzando Western blotting e semi-quantificato.La β-actina è stata utilizzata come controllo del carico.(E) La perossidazione lipidica, l'attività della superossido dismutasi e il rapporto GSH/GSSG sono stati determinati utilizzando il kit corrispondente.(F) I livelli di secrezione di insulina sono stati rilevati utilizzando il kit ELISA corrispondente e i livelli relativi di mRNA di (G) insulina 1 e (H) insulina 2 sono stati determinati tramite RT-qPCR.Le normali cellule INS-1 senza trattamento STZ, AS-IV, EX527 e MK2206 sono state servite come controllo.***P<0,001 vs Controllo;#P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs STZ+ AS-IV+.Abbreviazioni: AS-IV, astragaloside IV;STZ, streptozotocina;Bcl-2, regolatore dell'apoptosi BCL2;Bax, X associato a BCL2, regolatore dell'apoptosi;MDA, malondialdeide;SOD, superossido dismutasi;GSH-Px, glutatione perossidasi;INS, insulina.Per migliaia di anni, la medicina tradizionale cinese Astragalo è stata comunemente usata per curare molte malattie, incluso il diabete.1,2 Il suo principale principio attivo è l'AS-IV, un glicoside triterpenico di tipo cicloartano.Qui, nel presente studio, miriamo a studiare l'effetto di AS-IV sull'apoptosi e sulla disfunzione delle cellule β pancreatiche indotte da STZ e ad esplorare il potenziale meccanismo molecolare.È interessante notare che l'effetto protettivo di AS-IV sulla diminuzione indotta da STZ della vitalità cellulare INS-1 ha mostrato un aumento dose-dipendente in un certo intervallo.Questo effetto protettivo è stato osservato nei cardiomiociti, nelle cellule epiteliali tubulari renali e nelle cellule endoteliali capillari retiniche esposte a livelli elevati di glucosio.4,26,27 Inoltre, questi rapporti mostrano anche le proprietà anti-apoptotiche e antiossidanti dell'AS-IV.Allo stesso modo, nel presente studio, abbiamo anche osservato che attraverso il trattamento con AS-IV, l'apoptosi cellulare e lo stress ossidativo originariamente indotto da STZ sono stati alleviati in una certa misura.Le attività enzimatiche, tra cui la superossido dismutasi (SOD) e la glutatione perossidasi (GSH-Px), sono state significativamente migliorate.Attraverso la determinazione del contenuto di INS, insulina 1 e insulina 2 in diversi gruppi di cellule INS-1, lo studio attuale ha anche osservato che l'AS-IV ha un effetto terapeutico significativo sulla disfunzione delle cellule β pancreatiche delle cellule INS-1 indotta da STZ.Deng et al. hanno somministrato AS-IV a giovani ratti con chetoacidosi diabetica e hanno anche riscontrato un miglioramento dei livelli di insulina.Inoltre, questo studio ha anche analizzato il livello di fosforilazione di JNK e il livello di espressione della proteina Nrf2 nel tessuto pancreatico dopo la somministrazione e ha sottolineato che il suo potenziale meccanismo d'azione può coinvolgere la regolazione della via del segnale JNK/Nrf2 mediante il trattamento di AS-IV.28 SMSO del diabete di tipo 2 sembra coinvolgere anche la via antiossidante Nrf2.In un modello di ratto di diabete di tipo 2 indotto da una dieta ricca di grassi e zuccheri e STZ, SMSO induce l'espressione di Nrf2 e la fosforilazione di Akt e GSK3β in modo dose-dipendente per esercitare un effetto protettivo sulle cellule β del pancreas.6 Subito dopo , uno studio su un altro medicinale cinese Rg1 contro il danno miocardico causato dal diabete di tipo 1 ha anche evidenziato che può esercitare un effetto protettivo regolando la via di segnalazione Akt/GSK3β/Nrf2.7 Il presente studio ha rilevato che il livello di fosforilazione di Akt e GSK3β e il livello proteico di Nrf2 nelle cellule INS-1 trattate con AS-IV è aumentato in modo significativo.Al fine di confermare ulteriormente se il suo effetto protettivo coinvolge la via di segnalazione Akt/GSK3β/Nrf2, nel presente studio è stato utilizzato l'inibitore di Akt MK2206 ed è stato riscontrato che AS-IV ha avuto un effetto protettivo sulle cellule INS-1 indotte da STZ, tra cui apoptosi, stress ossidativo e disfunzione della secrezione di insulina, sono tutti indeboliti.Questi indicano che la via di segnalazione Akt/GSK3β/Nrf2 può essere una via di regolamentazione convenzionale per la medicina tradizionale cinese per il trattamento del diabete e delle sue complicanze.Anche la via di segnalazione SIRT1 svolge un ruolo importante nella prevenzione e nel trattamento del diabete e delle sue complicanze.29 L'uso dell'AS-IV per il trattamento dei cardiomiociti in un ambiente ad alto indice glicemico, ha migliorato significativamente il livello di SIRT1.4 Inoltre, l'AS-IV è stato anche trovato per invertire la transizione epiteliale-mesenchimale podocita indotta dal glucosio aumentando l'espressione di SIRT1 e diminuendo l'acetilazione di p53.30 Fenomeni simili sono stati osservati anche nei gangli della radice dorsale di ratti con neuropatia periferica dello zio.18 Nel presente studio, la regolazione di SIRT1 e È stato osservato anche p53 da AS-IV.Dopo il trattamento delle cellule INS-1 pre-incubate STZ con l'inibitore SIRT1 EX527, l'effetto citoprotettivo di AS-IV è risultato significativamente indebolito.Ancora più importante, dai risultati sperimentali si può vedere che le vie di segnalazione SIRT1/p53 e Akt/GSK3β/Nrf2 erano entrambe coinvolte negli effetti protettivi di AS-IV sull'apoptosi indotta da STZ, stress ossidativo e disfunzione delle cellule INS-1 (Figura 6).Tuttavia, la sua protezione contro l'apoptosi sembra essere principalmente attraverso la via di segnalazione SIRT1 e la sua protezione contro lo stress ossidativo e la regolazione della disfunzione sembra essere principalmente attraverso la via di segnalazione Akt/GSK3β/Nrf2.In generale, AS-IV può proteggere le cellule INS-1 regolando le vie di segnalazione SIRT1/p53 e Akt/GSK3β/Nrf2 e alleviare lo stress ossidativo, l'apoptosi e la disfunzione cellulare indotti da STZ.Questi risultati possono gettare le basi per l'utilizzo dell'AS-IV appartenente alla medicina tradizionale cinese come trattamento per il diabete.I set di dati utilizzati e/o analizzati durante lo studio in corso sono disponibili presso l'autore corrispondente su ragionevole richiesta.Tutti gli autori hanno dato un contributo significativo al lavoro riportato, sia nella concezione, nella progettazione dello studio, nell'esecuzione, nell'acquisizione dei dati, nell'analisi e nell'interpretazione, sia in tutte queste aree;ha partecipato alla stesura, revisione o revisione critica dell'articolo;ha dato l'approvazione definitiva alla versione da pubblicare;hanno concordato la rivista a cui è stato presentato l'articolo;e accetta di essere responsabile di tutti gli aspetti del lavoro.Questo studio è stato sostenuto dal Progetto del Dipartimento Provinciale dell'Educazione del Fujian (JAT201217).Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.1. Li L, Hou X, Xu R, Liu C, Tu M. Revisione della ricerca sugli effetti farmacologici dell'astragaloside IV.Fundam Clin Pharmacol.2017;31(1):17–36.doi:10.1111/fcp.12232Avv Pharmacol.Artif Cells Nanomed Biotechnol.Diabete Obes Metab.J Diabete Ris.J Cell Mol Med.Immunofarmaco Int.Biochimica Biophys Res Commun.Int J Mol Sci.Metabolismo cellulareJClin Invest.JClin Invest.Clin Sci.Biochim Biophys Acta Mol Cell Res.Diabete Metab Syndr Obes.Tossico in vitro.PLoS uno.Farmaco anteriore.Nutrizione.Diabete Metab Syndr Obes.Mondo J Gastroenterol.Drug Des Devel Ther.Arch Med Ris.Farmacother biomedico.Questo lavoro è pubblicato e concesso in licenza da Dove Medical Press Limited.I termini completi di questa licenza sono disponibili su https://www.dovepress.com/terms.php e incorporano la licenza Creative Commons Attribution - Non Commercial (unported, v3.0).Accedendo all'opera accetti i Termini.Gli usi non commerciali dell'opera sono consentiti senza ulteriore autorizzazione da parte di Dove Medical Press Limited, a condizione che l'opera sia adeguatamente attribuita.Per l'autorizzazione all'uso commerciale di quest'opera, consultare i paragrafi 4.2 e 5 dei nostri Termini.Contattaci • Informativa sulla privacy • Associazioni e partner • Testimonianze • Termini e condizioni • Segnala questo sito • TopContattaci • Informativa sulla privacy© Copyright 2022 • Dove Press Ltd • sviluppo software di maffey.com • Web Design di AdhesionLe opinioni espresse in tutti gli articoli qui pubblicati sono quelle degli autori specifici e non riflettono necessariamente le opinioni di Dove Medical Press Ltd o dei suoi dipendenti.Dove Medical Press fa parte di Taylor & Francis Group, la divisione Academic Publishing di Informa PLC Copyright 2017 Informa PLC.Tutti i diritti riservati.Questo sito è di proprietà e gestito da Informa PLC ("Informa") la cui sede legale è 5 Howick Place, London SW1P 1WG.Registrato in Inghilterra e Galles.Numero 3099067. 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